耳聋致病基因研究和临床应用下

在上一期文章中，我们介绍了耳聋相关的背景知识，包括耳聋分为哪些类别，常见的致病基因有哪些，以及这些基因行使什么功能。传送门在这里。这期我们来总结耳聋致病基因定位相关的科研思路。

写文章和做饭一样，炒菜技术固然重要，食材本身通常才是决定性因素。做研究之前，一定要选一个好的样本或家系来入手。精准医疗和临床咨询的逐渐普及，许多家庭希望通过致病位点筛查寻找新生儿患者的治疗方法，或者判断未出生的孩子是否会有耳聋的风险。这使得进行耳聋基因筛查的人数越来越多。

耳聋致病位点相关的科研新发现，一定是建立在临床筛查基础上的。但是，科研与临床是一个相反的过程：筛查到已知的致病位点是发不了文章的。因此，通过临床筛查，首先需要排除掉已知致病位点的样本。在临床上，大多数的基因panel都秉承了“抓住主要矛盾”的原则，尽可能囊括人群中突变频率较高的基因，例如GJB2、SLC26A4等。然而，发文章的机会就藏在那些“次要矛盾”之中。

下面就是研究方（tao）法（lu）了。

这篇文章有两个目的：（1）通过案例分析，讲清楚研究怎么做；（2）案例有低分文章（1-4分），也有高分文章（7-10分以上），看官们可以自己评价：做到什么程度大概能发到多少分。

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基因panel：大样本量筛查

前面已经提到，临床筛查是科研得以开展的基础。一般情况下，检测得到的多是一些热点突变，有些是数据库中明确报道致病的位点。如果运气好，可以在这些已知基因中发现未知的突变位点。很多测序panel都会覆盖目标基因的绝大多数外显子区域。但如果发现了某些位点没有任何报道，又可导致蛋白质功能损害，这就有可能是新位点了。

案例1

案例：捕获测序发现Usher综合征的USH2A新突变位点

原文：ShuH,BiH,PanY,etal.TargetedexomesequencingrevealsnovelUSH2AmutationsinChinesepatientswithsimplexUshersyndrome[J].BMCMedicalGenetics,,16(1):83-83.

IF：2.2

解读：Usher综合征是常染色体隐性病。研究使用了个基因的panel进行高通量测序，发现了USH2A基因上的c.AT位点发生突变，该突变与IVS47+1GA突变形成复合杂合突变。其中c.AT突变未曾有报道。经Sanger测序验证，该突变在家系中符合共分离规律。

案例2

案例：靶向测序发现耳聋相关的肌球蛋白新突变

原文：BrownsteinZ,AburayyanA,KarfunkeldoronD,etal.Novelmyosinmutationsforhereditaryhearinglossrevealedbytargetedgenomiccaptureandmassivelyparallelsequencing[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,,22(6):-.

IF：4.3

解读：肌球蛋白超家族由超过35个不同的类别组成，其中几种已在内耳中被证明起关键作用，。本研究的受试者为96个以色列犹太人和巴勒斯坦耳聋患者家庭，使用了个基因的AgilentSureSelect平台靶向捕获panel。研究发现了MYO3A、MYO6、MYO7A和MYO15A基因的数个新突变，并对这些突变进行了家系内的共分离验证，在蛋白2D和3D结构域上讨论了这些突变可能带来的影响。

就算没有发现新的突变，也还可以统计一下不同人群已知基因突变的发生频率。如果人群基数大，或者是某个特殊的少数民族群体，那么还是有一定的参考价值的。

案例3

案例：个汉人的12SrRNA基因突变频率

原文：ShenZ,ZhengJ,ChenB,etal.Frequencyandspectrumofmitochondrial12SrRNAvariantsinHanChinesehearingimpairedpediatricsubjectsfromtwootologyclinics[J].JournalofTranslationalMedicine,,9(1):4-4.

IF：3.8

解读：研究对名患者的线粒体12SrRNA进行了测序，其中98名有氨基糖苷类药物使用史。在所有人中，已知耳聋相关突变AG，CT和TC发生率分别为7.5%，0.45%和0.91%，而在98例中为21.4%，2%和2%。该结果说明线粒体12SrRNA突变占氨基糖苷类诱发性耳聋的30%左右，是突变的热点。

2

挑选样本，定位致病基因

通过前期的筛查，排除掉已知致病原因的样本以后，就可以对剩下的候选样本进行致病基因定位了。一般有两种策略：（1）直接对患者和家系中的正常个体进行全外显子组测序，根据共分离原则进行候选致病位点筛选；（2）或者使用SNP芯片进行连锁分析，定位到具体区段后在其中寻找突变位点。在样本难以取得的情况下（家系成员不配合、过世等情况），可对有限的个体进行测序筛选；如果家系拿得比较全，还是推荐使用连锁分析+测序筛选的策略，可以一次性得到较为可信的结果。

对患者和正常个体进行测序后，通过筛选共分离规律（患者携带，非患者不携带）、人群基因频率（MAF0.01）、功能性突变（错义、无义、移码、选择性剪切等）以缩小目标，可以找到一些候选基因位点，再通过Sanger测序在家系中验证共分离规律。如果运气差的话，找到的会是panel以外的已知致病基因，只能祈祷发现的是个新位点了。

案例4

案例：外显子测序鉴定出非综合征型耳聋致病基因POU4F3

原文：CaiXZ,LiY,XiaL,etal.ExomesequencingidentifiesPOU4F3asthecausativegeneforalargeChinesefamilywithnon-syndromichearingloss[J].JournalofHumanGenetics,.

IF：2.5

解读：该研究使用全外显子组测序发现已知POU4F3基因的一个新移码突变c.delT,p.Lfs，并且通过了一代测序进行共分离的验证。

如果碰到样本的表型很罕见，则有很大概率可以发现新基因。那么相信研究者一定不会放过这个机会，把能做的功能实验全部做一遍，像下面这篇案例。

案例5

案例：外显子测序发现耳聋-甲营养不良综合征新基因ATP6V1B2

原文：YuanY,ZhangJ,ChangQ,etal.DenovomutationinATP6V1B2impairslysosomeacidificationandcausesdominantdeafness-onychodystrophysyndrome[J].CellResearch,,24(11):-.

IF：15.6

解读：耳聋-甲营养不良综合征（DDODsyndrome，MIM）主要表现为指甲发育不良或缺失，伴随先天感音神经性耳聋。研究使用全外测序对2个核心三人家系（父、母、子）筛查突变，发现了ATP6V1B2基因的无义突变。为了研究该突变的意义，通过该基因敲降的小鼠模型，使用脑干听力模型（ABRtest）观察到敲降的小鼠对声音的阈值升高（听力变差）。免疫染色发现该基因在毛细胞和耳蜗螺旋神经节细胞表达最低，且westernblot显示敲降7天时Atp6v1b2表达在这两种细胞中明显下降，随着21天时在Corti器中也显著下降。研究者还构建了突变型和野生型HEK细胞系，观察到了ATP水解酶活性显著差异，证明ATP6V1B2c.CT是一个单倍体不足突变。

在家系较大时，可采用SNP芯片和外显子组测序相结合的策略，这是比较推荐的研究方法，基于SNP芯片的连锁分析可以提供统计学意义上的染色体定位。有了初定位的结果，再结合全外显子组的位点筛选，可以在分析阶段将候选目标缩减至个位数位点。

案例6

案例：全基因组连锁分析和外显子测序在非综合征耳聋家系中鉴定DMXL2基因变异

原文：Chen,D.Y.,etal.,AdominantvariantinDMXL2islinkedtononsyndromichearingloss.GenetMed,.

IF：7.7

解读：研究使用了Illumina中华8芯片对一个非综合征型耳聋家系的21个样本（10病例，11正常）进行了连锁分析，找到了15号染色体9.86Mb长度的致病候选区段（LOD=4.03），其中未包含已知致病基因。随后，对3个患病个体和1个正常对照进行全外显子组测序，在这个区段找到3个候选致病变异。使用Sanger测序在家系共分离验证后，发现DMXL2基因的一个非同义突变为致病候选位点。通过小鼠的免疫染色实验，可以观察到此基因主要表达于毛细胞和螺旋神经节细胞。

3

拷贝数变异与杂合性缺失

使用全外显子组测序没筛选到候选基因？别忘了还有一种重要的遗传致病因素：拷贝数变异和杂合性缺失。它们在功能上主要有两方面影响：（1）拷贝数变化会导致基因出现剂量效应，从而影响到表达量，造成相应通路功能紊乱；（2）染色体缺了一条后，或者出现杂合性缺失时（两条染色体均遗传自父亲或者母亲），父母一方携带的本来无害的杂合性致病位点变成纯合，开始变得有害。

在研究结果的新意上，拷贝数变异是一种新的突变类型，是值得进行功能相关研究的。杂合性缺失除非是发生在新基因或新位点上，否则不值得报道。当然，在临床上两者都是值得







































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